Od chvíle, kdy se Peter Parker (TOBEY MAGUIRE) rozhodl opustit svou dlouholetou lásku Mary Jane Watson (KIRSTEN DUNST), aby se mohl v kostýmu Spider-Mana i nadále zodpovědně věnovat svému povolání superhrdiny, uplynuly dva roky. Jeho touha po milované M.J. se ale postupem času stala ještě silnější a proto si nyní pohrává s myšlenkou, že by se tajného života superhrdiny na důkaz své lásky vzdal. M.J. se však mezitím rozhodla jít dál vydala se na dráhu filmové herečky a v jejím životě figuruje nový muž.

Peter má problémy i se svým nejlepším přítelem Harrym Osbornem (JAMES FRANCO). Jejich kamarádský vztah začíná být stále více zastíněn Harryho záští vůči Spider-Manovi, jehož viní ze smrti svého otce. Když už se zdá, že se situace nemůže změnit k horšímu, je Peter postaven tváří v tvář mocnému Dr. Octopusovi (ALFRED MOLINA) ďábelské stvůře s dvěma páry smrtících chapadel, která je mu více než důstojným protivníkem. Aby dokázal jeho řádění zastavit, musí se naučit žít se svým osudem a využít všech svých schopností, které jsou mu zároveň darem i prokletím.